ANTIESTROL-DUO

Prueba rápida para la determinación
de antiestreptolisina O, en sangre entera
y suero
”Para uso in vitro”


INTRODUCCIÓN
Las infecciones causadas por estreptococos, son frecuentes y es por ello que los anticuerpos antiestreptolisina O están presente en casi todos los individuos, en diferentes niveles, indicándose como valores de referencia, títulos iguales o menores a 200 UI/ml.
 La presencia de títulos altos de antiestreptolisinas O indican una infección por Estreptococo betahemolítico del tipo A, que puede producir una glomerulonefritis, una fiebre reumática, una endocarditis bacteriana o una escarlatina.
 La elevación de los anticuerpos aparecen a la semana de la infección por el estreptococo, los valores más elevados se dan en la tercera semana de la infección y es cuando pueden aparecer las enfermedades secundarias a esta infección (glomerulonefritis, una fiebre reumática, una endocarditis bacteriana o una escarlatina) pero no son específicos de ninguna de ellas. Deben ser diagnosticadas cada una de ellas por la clínica o por otros estudios diagnósticos.

USO AL QUE ESTA DESTINADO
Antiestrol-Duo está destinado a la determinación de antiestreptolisina O.
Se puede utilizar como prueba de screening, en sangre entera, para descartar muestras con un nivel de antiestreptolisina O igual o menor a 200 UI/ml, como también titular, en suero, las muestras con niveles superiores a 200 UI/ml.
(www.brizuela-lab.com.ar/Antiestrol-Duo.htm)

FUNDAMENTO

Los anticuerpos antiestreptolisina O, presente en la sangre entera, son neutralizados por la estreptolisina O absorbida al disco de papel. Si el título de anticuerpos es menor a la cantidad de estreptolisina contenida en el disco, quedará un remanente de estreptolisina O, que provocará la hemólisis de los hematíes. En caso contrario, la totalidad de la estreptolisina O quedará neutralizada por los anticuerpos y por lo tanto no se observará la hemólisis de los hematíes.

ELEMENTOS DEL SISTEMA
Provisto
Discos de Papel: (Para la técnica de Screening) discos con la inscripción DUO, absorbidos con estreptolisina O.
Estreptolisina O: (Para la técnica de titulación): Estreptolisina O estandarizada.
Buffer Reductor Concentrado:
Buffer de fosfatos conteniendo fosfatos 0,36 mol/l, cloruro de sodio 1,2 mol/l y sulfito de sodio 65 mol/l, para pH final 6,6 ± 0,2 (25ºC).
No provisto
Suspensión de eritrocitos (Para la técnica de titulación)
 
MATERIAL REQUERIDO
No provisto
Tubos de Hemólisis
Micropipeta o Pipeta automática
Pipetas de vidrio
Gradilla
Baño maría
Cronómetro
Centrífuga
Pinza

INSTRUCCIONES PARA SU USO
Estreptolisina O: (Sólo para la técnica de titulación) disolver con el volumen de buffer reductor indicado en el rótulo. Una vez disuelto dejar reposar 10 minutos a temperatura ambiente, antes de utilizar. Sólo se debe utilizar buffer reductor de estreptolisina (provisto), pues si utiliza otro buffer de estreptolisina que no sea reductor, no se producirá la reacción hemolítica.
Buffer Reductor Concentrado:
Antes de usar, diluir con agua destilada con el volumen que indica la etiqueta. A bajas temperaturas, este buffer concentrado puede cristalizar. Si esto sucede, coloque el envase durante algunos minutos en baño de agua a 37ºC, mezclando por inversión hasta dilución total.

ESTABILIDAD Y CONSERVACIÓN
Los reactivos provistos son estables hasta la fecha indicada en su envase, conservados entre 2-10ºC.
Estreptolisina O: una vez reconstituida es estable por 1 hora a temperatura ambiente, 2 días entre 2-10ºC o un mes congelada a          -20ºC. Si se congela es conveniente fraccionar el volumen a utilizar para evitar el congelamiento y descongelamiento, lo que provoca su deterioro.
Buffer Reductor: una vez diluido Esta solución es estable durante 1 año conservada entre 15-30°C o 2 años conservada entre 2-10°C.

MUESTRA
Técnica de screening

 Sangre entera recogida con anticoagulante para hematología. No utilizar anticoagulantes a base de fluoruros. La sangre a utilizar deberá estar libre de hemólisis. Realizar la determinación en el día, de no ser posible podrá conservarse durante 48 hs entre 2-10ºC, verificando que no haya hemólisis. Homogenizar, en forma suave, la sangre antes de ser utilizada.
Blanco de Muestra: Es importante realizar un tubo “Blanco de Muestra” para verificar que la sangre utilizada no presenta hemólisis. Para ello realizar el procedimiento de la Técnica de Screening pero sin agregar el disco de estreptolisina.

Técnica de Titulación
Suero o plasma extraído con anticoagulante para hematología. No utilizar anticoagulantes a base de fluoruros. La hemólisis ligera no interfiere en los resultados. Si la muestra no se procesa en el día, el suero puede conservarse durante 72 hs. entre 2-10ºC o una semana a -20ºC.

PROCEDIMIENTO
Técnica de Screening
Dejar que los reactivos tomen temperatura ambiente. En un tubo de hemólisis colocar:

Sol.  Buffer Reductor dil.

1 ml

Sangre entera bien homogenizada

10 ul

Disco de Estreptolisina O

1 disco

Agitar el tubo durante 30 segundos. Colocar el tubo a baño maría a 37ºC, durante 5 minutos, verificando que el disco que sumergido en el fondo del tubo. Retirar del baño y centrifugar, durante 1 minuto. Observar la presencia o ausencia de hemólisis.
Si al retirar del baño maría el tubo presenta marcada hemólisis, no hace falta centrifugar y se informará como menor a 200 UI/ml
Nota: Limpiar el exterior del tips o micropipeta antes de introducir la sangre en el buffer reductor. Enjuagar varias veces en el mismo, verificando que no quede sangre adherida a las paredes de la pipeta o tips.

Técnica de Titulación
La muestra que de título alto (ausencia de hemólisis) en el procedimiento anterior, puede ser titulada por el método de inhibición de la hemólisis.

  • Estreptolisina O: (Ver Instrucciones para su uso)
  • Suspensión de Eritrocitos: Se deberán emplear eritrocitos humanos obtenidos de sangre extraída con anticoagulantes para hematología. No deberán emplearse anticoagulantes que contengan fluoruro. Se podrán emplear también los restos de sangre que haya sido empleada para pruebas de eritrosedimentación. Los glóbulos rojos deberán lavarse con solución buffer reductor diluido, para lo cual se suspenderán en un volumen cinco veces mayor de solución buffer reductor  y se centrifugará durante cinco minutos descartando el sobrenadante. Esta operación deberá repetirse hasta que no se observen restos de hemólisis en el sobrenadante (generalmente 3 o 4 veces). Después del último lavado, descartar el sobrenadante y con el paquete globular, realizar una suspensión al 5% v/v, en solución buffer reductor diluido.

Suero o plasma: Realizar una dilución 1:100 y 1:500, en buffer reductor diluido de acuerdo a:

 

Dilución 1:100

Dilución 1:500

Suero o Plasma

100 ul

2 ml de dil. 1:100

Buffer reductor diluido

9,9 ml

8 ml

En una gradilla colocar 8 tubos de hemólisis numerados y agregar:

 

Dilución 1:100

Dilución 1:500

Tubo Nº

1

2

3

4

5

6

7

8

Muestra dil. (ml)

0.3

0.2

0.15

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

Buffer reductor dil.(ml)

0.2

0.3

0.35

-

0.1

0.2

0.3

0.4

Solución Estrep.
(ml)

0.25

0.25

0.25

0.25

0.25

0.25

0.25

0.25

Agitar y colocar la gradilla a baño maría 37ºC, durante 15 minutos. Retirar
del baño y colocar:

Glob. rojos al 5% (ml)

0.25

0.25

0.25

0.25

0.25

0.25

0.25

0.25

Agitar para homogenizar y colocar la gradilla a baño maría 37ºC, durante 30 minutos. Retirar del baño y centrifugar los tubos 2 a 3 minutos. Retirar los tubos de la centrifuga y observar la presencia o ausencia de hemólisis.

Títulos en UI/ml

166

250

333

500

625

833

1250

2500

EXPRESION DE LOS RESULTADOS
Técnica de Screening
Tubo con hemólisis: título igual o menor a 200 UI/ml
Tubo sin hemólisis: título superior a 200 UI/ml
NOTA: Los tubos con títulos superiores a 200 UI/ml, no se verán completamente límpidos. Presentarán una ligera coloración amarillenta, pero muy fácilmente diferenciables de los tubos con hemólisis. Esto es debido a la pigmentación del plasma de la sangre entera.
Técnica de Titulación
Título: el titulo se determina por el último tubo donde ha habido inhibición de hemólisis. Los títulos correspondientes a cada tubo se indican en la  última fila de la tabla anterior.
Ej: Si el primer tubo que presentare hemólisis fuese el  Nº 5, el título a informar como resultado será 500 UI/ml (correspondiente al tubo Nº 4).

LIMITACIONES Y CUIDADOS

  • El producto, antes de utilizarse, no representa ningún riesgo. Los tubos utilizados, deben tratarse como un  “Residuo Patógeno” y aplicar las medidas de bioseguridad al respecto.
  • No utilizar el producto después de su fecha de vencimiento.
  • Utilizar sólo buffer reductor para Estreptolisina (provisto), si utiliza un buffer para Estreptolisina, que no sea reductor, no se producirá la reacción hemolítica.
  • No utilizar los discos si la sílica gel, contenida en el envase, a virado de color al rosa.
  • No utilizar muestras con hemólisis (ver Blanco de muestra. Técnica de Screening).
  • Los tubos con una ligera coloración deben ser considerados como “sin hemólisis
  • En muestras con valores de antiestreptolisina O entre 200 y 250 UI/ml, se pueden presentar discrepancias entre la técnica de
     screening y la técnica de titulación, ya que la técnica de screening dará como resultado un título superior a 200 UI/ml y la titulación nos indicará un título de 166 UI/ml.

Títulos falsos altos: Se pueden obtener títulos falsos altos cuando:

  • En la técnica de screening, no se limpia exteriormente el tips o micropipeta, antes de colocar la sangre en el buffer reductor. Por lo tanto se estará agregando más cantidad de anticuerpos.
  • En la técnica de titulación no se respetan los tiempos de reposo y/o agitado de la solución de estreptolisina.
    Títulos falsos bajos: Se pueden obtener títulos falsos bajos cuando:

  • En la técnica de screening, se introduce menos cantidad de sangre o no se enjuaga el tips o micropipeta dentro del buffer reductor. Por lo tanto se estará colocando menor cantidad de anticuerpos.
  • En la técnica de screening se utiliza sangre con hemólisis.

PERFORMANCE
Sensibilidad: 200 UI/ml

Especificidad: en población adulta sana se obtienen títulos iguales o menores a 200 UI/ml, en un 94-96% de los casos. En niños entre 4-12 años pueden hallarse valores de hasta 300 UI/ml

CONTROL DE CALIDAD

Control positivo de hemólisis: se puede realizar reemplazando la sangre problema por 10 ul de sangre lavada 3 a 4 veces con solución fisiológica o buffer diluido. En este caso se verifica la capacidad hemolítica de la estreptolisina, contenida en el disco, lo que da por resultado un tubo con franca hemólisis.

Control negativo de hemólisis: realizar el procedimiento, de la técnica cuantitativa, como indica el manual de instrucción, pero sin agregar el disco de estreptolisina. El resultado en este caso será un tubo libre de hemólisis.

BIBLIOGRAFIA

  • L.A. Rantz; J.M. Discarpio  “Am. J. Med. Scl. (1952) 224;

PRESENTACION
Equipo para 12 determinaciones de screening y 2 titulaciones.
Equipo para 25 determinaciones de screening y 4 titulaciones.
Equipo para 50 determinaciones de screening y 6 titulaciones.
Equipo para 100 determinaciones de screening y 16 titulaciones.

 

Producto elaborado por
Laboratorios W. Brizuela S.A.
Av. Figueroa Alcorta 123/139- 5000 Córdoba (Argentina)

www.brizuela-lab.com.ar
www.brizuela-lab.com.ar/Antiestrol-Duo.htm
info@brizuela-lab.com.ar
Director Técnico: Bioq. Marcelo Brizuela
Producto Autorizado ANMAT  PM-008-2