DETERMINACION DE LA SUSCEPTIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS
POR DIFUSION EN AGAR (
Técnica de Kirby-Bauer)


DISCOS

Si bien ANMAT (Administración Nacional de Medicamentos, Alimentos y Tecnología) recomienda no utilizar más de 6 antimicrobianos por placa de 10 cm de diámetro, LABORATORIOS BRIZUELA rediseño sus discos múltiples incorporando sólo 5 antibióticos para lograr de esta  manera adaptarlos a los nuevos criterios bacteriológicos internacionales vigentes (Clinical Microbiology 7° edición 1999) (NCCLS M2-A5 1993 )que recomiendan el uso de sólo 5, separados a una distancia mayor a 2,4 cm entre centros.
En las nuevas estrellas se cumplen todas las recomendaciones y se obtiene una separación entre centros de 3,1 cm. Con esto se logra evitar la interacción entre antimicrobianos y obtener halos completos dentro de la placa


La conservación de los mismos es muy importante para obtener un resultado confiable. Se deberán conservar a la temperatura que indique el envase y previamente se deben dejar que tomen temperatura ambiente durante 1 ó 2 horas, para evitar la condensación que pueda ocurrir. No se deberá usar discos cuyo vencimiento haya expirado. El envase contiene sílica gel con indicador de humedad, por lo tanto si la sílica gel ha virado del azul al rosa, indica la presencia de humedad dentro del mismo y se deberán descartar los discos.


MEDIO DE CULTIVO

Se deberá usar agar Muller Hinton, pues este medio proporciona una buena reproductibilidad lote a lote, es pobre en contenido de inhibidores de sulfonamidas, trimetoprima y tetraciclinas. Además, brinda crecimiento satisfactorio para muchos patógenos  El contenido excesivo de timidina, puede causar la obtención de halos de inhibición menores, cuando se ensaya con Trimetoprima.Para evaluar el contenido de timidina en un lote de agar Muller Hinton se puede usar una cepa control de S. faecalis ATCC 29212 , con discos de Trimetoprima. Medios con contenido satisfactorio de timidina, darán zonas claras de inhibición mayor a 24 mm.

El pH del medio deberá estar entre 7,2 - 7,4


INOCULO

La suspensión de gérmenes que habrá de utilizarse para la realización de la prueba deberá provenir de cultivos monomicrobianos. Para la correcta preparación del inóculo se deberá comparar con un patrón de turbidez el cual se prepara mezclando 0.5 ml de una solución de Cl2Ba (48 mmol/L) y 99,.5 ml de una solución de H2SO4 (180 mmol/L). Este patrón de turbidez puede fraccionarse en tubos, similares a los que se utilizarán para la preparación del inóculo, se cerrarán perfectamente y se deberán conservar refrigerado durante un periodo de 6 meses.

Antes de ser utilizado de deberá agitarse antes de proceder a la comparación.Para la preparación del inóculo se tomarán 4 ó 5 colonias del germen en estudio y se suspenderán en una porción de caldo Tripto Soya, hasta lograr una turbidez, a ojo desnudo, comparable al patrón de turbidez. En caso de obtener una suspensión con turbidez menor al patrón se podrá incubar a 37 º C, durante algunas horas, hasta igualar a la turbidez del patrón. En caso de que el inóculo sea de concentración menor a la referida se obtendrán halos mayores y viceversa.

PREPARACION DE LAS PLACAS

La altura de la capa de agar deberá ser de 4 mm aproximadamente, una vez colocado el agar se taparán y se dejará solidificar el agar y se procederá al secado de las mismas para retirar el exceso de humedad, para lo cual se colocarán invertidas en estufa a 37º C, durante 10 a 30 minutos.
Pueden conservarse durante 7 días, refrigeradas, teniendo la precaución de evitar la evaporación. Las placas deben tomar temperatura ambiente antes de ser sembradas.

INOCULACION DE LAS PLACAS

Existen varias técnicas estandarizadas para la aplicación del inóculo, pero la más sencilla es por escobilladura, para lo cual se embebe un hisopo estéril en la suspensión previamente preparada, se elimina el exceso de líquido haciendo rotar el hisopo contra la pared del tubo y se aplica sobre la superficie de la placa efectuando un barrido en por lo menos tres direcciones, girando el hisopo en cada dirección.

APLICACION DE LOS DISCOS E INCUBACION DE LAS PLACAS

Aplicar los discos con la ayuda de una pinza esteril ejerciendo una ligera presión sobre la superficie del medio. Debido a la rápida difusión del antimicrobiano, no se deberá mover el disco una vez colocado en la placa. Después de 10 minutos pero antes de los 15 minutos de aplicados los discos, se deberá comenzar la incubación a 35 - 37º C, durante 18 a 24 horas.

LECTURA DE LOS DIAMETROS E INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS

Luego de la incubación de las placas se procederá a la lectura de los halos de inhibición, con la ayuda de un calibre o regla se medirá el diámetro de la zona de inhibición completa.

De acuerdo a los diámetros obtenidos se informarán como Sensibles, Intermedios o Resistentes , según corresponda, basado en la Tabla de Interpretación de Resultados (N.C.C.L.S.)

LIMITACIONES Y CUIDADOS


  • Si los discos no se mantienen dentro del rango de temperatura indicado en el envase, y no se protegen de la humedad, pueden inutilizarse, arrojando resultados falsos resistentes.
  • No utilizar discos cuyo vencimiento haya expirado.
  • El cambio de color, del azul al rosa, del desecante contenido en el envase, indica la presencia de humedad dentro del mismo, por lo tanto se deberán desechar los mismos.
  • Utilizar sólo medio de cultivo Muller Hinton, ajustando su pH y controlando la concentración de timidina. El uso de otros medios de cultivo pueden inducir a error.
  • El espesor de la capa de agar deberá ajustarse a 4 mm. Una capa demasiado delgada, producirá halos de inhibición más amplios y viceversa.
  • La turbidez del inóculo se deberá estandarizar correctamente, pues un inóculo de menor turbidez determinará halos de inhibición más grandes y viceversa.

CONTROL DE CALIDAD


Cuando puedan existir dudas acerca de los resultados obtenidos en los ensayos de rutina, pueden efectuarse pruebas con cepas de referencia. Los resultados obtenidos deberán estar comprendidos dentro de los rangos que correspondan a dichas cepas.
Las cepas patrones son las siguientes: Escherichia coli ATCC 25922 - Estafilococo aureus ATCC 25923 - Pseudomona aureginosa ATCC 27853 y la Escherichia coli ATCC 35218. Esta última se deberá ensayar con los discos que poseen combinaciones de betalactámicos y de inhibidores de betalactamasa.